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細(xì)菌中分離純化質(zhì)粒DNA
更新時(shí)間:2012-01-06   點(diǎn)擊次數(shù):1608次

1. 細(xì)胞壁的消化,將細(xì)菌溫育在裂解液中去除細(xì)胞壁中的肽聚糖。通常在等滲的情況下進(jìn)行此步,以防止細(xì)胞漲破釋放出染色體DNA分子。注意,革蘭氏陽性菌對裂解酶相對不敏感,需要額外的處理以使酶到達(dá)細(xì)胞壁層,例如,可采用滲透壓休克或保溫在螯合劑中,如EDTA。EDTA也能使一些細(xì)菌的脫氧核糖核酸酶失活,以防止在提取過程中,質(zhì)粒DNA降解。

2. 利用強(qiáng)堿(NaOH)和其他試劑,如十二烷基磺酸鈉溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)部分變性。再中和此溶液使不溶性染色體DNA沉淀,質(zhì)粒DNA存于溶液中。

3. 移去其他的大分子物質(zhì),特別是RNA和蛋白質(zhì),這可利用核糖核酸酶和蛋白酶進(jìn)行酶促消化。另一些化學(xué)純化步驟可增加質(zhì)粒DNA的純度,例如可將提取物同水飽和酚或酚/氯仿混合物混合,以除去蛋白質(zhì)。再離心,DNA留在上面的水層,蛋白質(zhì)則分離在下面的有機(jī)溶劑層。重復(fù)酚/氯仿提純的循環(huán)可降低樣品中這些大分子蛋白的含量到zui少。還可通過等密度的CsCl梯度離心法得到純化的DNA。

4. 利用體積分?jǐn)?shù)為70%左右的乙醇沉淀DNA,離心,得到的DNA沉淀,再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗,其中的水將除去先前階段的鹽污染。經(jīng)過提純的DNA,可冷凍保存?zhèn)溆?,或重新溶解在緩沖液中。

 

 

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